Стандартна установка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) складається з чотирьох етапів:
- Додайте необхідні реагенти або майстер-мікс і шаблон до пробірок для ПЛР.
- Перемішати і центрифугувати. …
- Підсилюйте відповідно до параметрів термоциклера та праймера.
- Оцініть ампліфіковану ДНК за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з наступним фарбуванням бромістим етидієм.
Праймери ПЛР є короткі одноланцюгові сегменти ДНК, призначені для комплементарності початку та кінця цільової послідовності, яка буде ампліфікована. У ПЛР саме праймери визначають, яка саме послідовність ДНК буде скопійована.
HLA-типування за допомогою послідовно-специфічних праймерів (PCR-SSP). широко використовуваний метод HLA-типування, у якому кілька пар цис-розташованих алель-специфічних праймерів використовуються для визначення алелів, присутніх у даному зразку ДНК.
Буквар є коротка послідовність нуклеїнової кислоти, яка є відправною точкою для синтезу ДНК. У живих організмах праймери являють собою короткі нитки РНК. Праймер повинен бути синтезований ферментом, який називається праймазою, який є різновидом РНК-полімерази, перш ніж може відбутися реплікація ДНК.
ПЛР базується на трьох простих кроках, необхідних для будь-якої реакції синтезу ДНК: (1) денатурація матриці на окремі нитки; (2) відпал праймерів до кожного вихідного ланцюга для синтезу нового ланцюга; і (3) подовження нових ланцюгів ДНК з праймерів.
PCR Primer Design Поради
- Прагніть до того, щоб вміст GC був між 40 і 60%, а 3' праймера закінчується на G або C для сприяння зв’язуванню. …
- Хороша довжина праймерів ПЛР зазвичай становить близько 18-30 основ. …
- Спробуйте зробити температуру плавлення (Tm) праймерів між 65°C і 75°C і в межах 5°C одна від одної.